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我院主持制定国标深度解读系列(一)——GBT3

  原标题:我院主持制定国标深度解读系列(一)——GB/T33409-2016《β-半乳糖苷酶活性检测方法分光光度法》

  β-半乳糖苷酶,别名乳糖酶,主要作用是使乳糖水解为葡萄糖和半乳糖,是一种研究糖代谢和蛋白糖基化的重要科研用酶。作为免疫分析中的新型工具酶,其干扰小,底物无致癌性且显色稳定,与荧光底物相结合可作超微量荧光酶分析,对微量激素药物的定量分析,以及病毒、单科隆抗体等测定非常灵敏。利用β-半乳糖苷酶的糖苷转移作用人工合成糖苷化合物,对药品和其他生理活性物质的合成有潜在意义。此外,β-半乳糖苷酶被广泛应用于农业、化学、医药等多个领域。在农业领域,其主要用于乳糖的分解和乳清的回收利用;在饲料生产中,β-半乳糖苷酶主要作为饲料添加剂用于降解饲料中存在的半乳糖苷等抗营养因子,降低食糜粘度,减少动物腹泻的发生。用固定化的β-半乳糖苷酶催化合成的中等链长的醇基-糖苷表面活性剂,已成为乳化剂的重要一族。因此,β-半乳糖苷酶制剂的活性将直接影响相关产品的生产。而对于酶活的测定,由于缺乏统一的标准,各个厂商的分析方法都不尽相同。并且其酶活力单位是否和厂家标识的酶活力单位一致还缺乏相关的标准进行规范约束和验证。导致市场上β-半乳糖苷酶的质量难以得到保证。直接影响到相关厂家β-半乳糖苷酶原料的把控,也使得在进行生化实验中也难以确保实验数据的重复性,科学性和准确性。因此对于β-半乳糖苷酶活性测定标准的建立势在必行。

  基于硝基苯-β-D-半乳糖苷作为底物的分光光度法是目前使用最广且最权威的β-半乳糖苷酶活性测定方法。美国食品药品法典第五版(FCC Ⅴ)和AOAC发布的方法(AOAC Official Method 998.04)规定在30℃、pH6.5时每分钟催化转化一个微摩尔邻硝基苯-β-D-半乳糖苷的酶量为一个活力单位。但各个β-半乳糖苷酶生产厂家用于标示其产品酶活力的测定方法不尽相同。虽然其测定原理和上述标准相同,但是反应温度、底物浓度、反应体系的pH、终止液配方均有所差异,导致其标示的产品酶活力值不能通用。Sigma公司β-半乳糖苷酶活力定义温度为37℃、pH7.3的条件下,每分钟催化水解1.0 μM邻硝基苯-β-D-半乳糖苷的酶量为一个活力单位。Merck公司为25℃、pH6.5;而Worthington公司则为25℃、pH7.5。在邻硝基苯-β-D-半乳糖苷底物浓度的选择上,美国食品药品法典第五版和AOAC发布的标准均为2.5g/L,而1989年出版的《酶应用手册》在反应温度,缓冲体系以及终止液与上述标准方法无明显区别的情况下,推荐的底物浓度为4.0g/L。

  除了传统的分光光度法以外,近年来新的β-半乳糖苷酶活力测定技术不断被报道。2010年,Liu报道了1,2-二环氧丁烷作为化学发光底物使用Galacto-Light Plus分析系统检测β-半乳糖苷酶活力的化学发光检测方法。该方法灵敏度高,但是所使用的试剂和需要配备的化学发光检测仪价格昂贵。

  2013年Otsubo报道了β-半乳糖苷酶活性荧光检测法。其检测采用2-苯并噻唑基-2-硝基苯-β-D-半乳糖苷为衍生物合成了一种新的非荧光底物,该底物可被β-半乳糖苷酶水解生成强荧光信号的产物从而被荧光检测器检测。规定在30℃、pH6.5时,每分钟催化转化一个微摩尔2-苯并噻唑基-2-硝基苯-β-D-半乳糖苷的酶量为一个活力单位。与比色法相比,荧光检测法将β-半乳糖苷酶活力的测定灵敏度提高了3-4个数量级。但是荧光法的底物目前无商品化试剂,衍生过程繁琐且不易掌握。

  国内郑红等采用褶合光谱法对β-半乳糖苷酶活力进行了测定。其采用含镁离子的pH7.5的磷酸盐缓冲体系,使用褶合光谱仪软件分析系统进行分析。其优点在于由于不需使用标准曲线,操作较为简便,但是该分析系统普及率不高,不适合作为标准方法推广。

  含生色糖苷配基的糖类已被广泛用于糖苷水解酶类的酶测定和组织学染色。其中6-溴-2-萘-2-半乳糖苷可用于鉴定动植物组织中的半乳糖苷酶。其染色原理是酶解后的产物可与坚固蓝B盐反应,生成水不溶性的紫色物质。基于此原理建立的半乳糖苷酶聚丙烯酰胺凝胶电泳的活性染色方法被用于半乳糖苷酶活性测定。该方法由于采用丙烯酰胺凝胶进行预分离,适用于基质较为复杂的样品。但是该方法结果判断主观性强,定量不准确。

  王晓兰应用 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷(X-gal)试纸建立一种快速检测β-半乳糖苷酶活性的方法。其原理在于酶色原底物 X-gal 在β-半乳糖苷酶作用下产生蓝色的 5-溴-4-氯-3-吲哚。该方法主要用于微生物的β-半乳糖苷酶活性实验,操作复杂,耗时,并且只能对样品进行定性。

  综合以上各方法的优缺点,在本标准中采纳了硝基苯-β-D-半乳糖苷作为底物的分光光度法为酶活性检测方法,并采用在30℃、pH6.5时,每分钟催化转化一个微摩尔邻硝基苯-β-D-半乳糖苷的酶量作为一个活力单位的酶活定义。该方法采用的试剂安全,操作简便,重现性好,所使用的仪器紫外分光光度计为目前国内各大实验室必备的检测仪器,可以方便标准检测的实施。

  由于β-半乳糖苷酶有各种来源,目前已报道的就超过50种之多,每种酶的酶学性质都有所不同,然而很多酶还处于实验室研究阶段,无法收集到样品。因此本标准在编制过程中,主要考察已经商品化的β-半乳糖苷酶,如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、脆壁酵母(Saccharomyces fragilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)发酵生产的β-半乳糖苷酶。

  样品的基质对检测结果的影响也是巨大的,本标准主要适用于生化试剂、工业酶制剂中β-半乳糖苷酶活性的测定。这些样品酶含量和活性均较高,基质对检测结果的影响小。其他样品未经逐一评估,相关单位经过方法验证后,确认无基质干扰后可参照使用。

  不同来源的β-半乳糖苷酶的性质差异较大,如黑曲霉和大肠杆菌来源的β-半乳糖苷酶的最适pH分别为4.5和7.3。因此,检测之前必须确定酶的生物来源,以免用错测试条件。

  酶活性测试由于酶浓度和催化显色吸光度的线性区间较窄,因此必须稀释到标准所述的酶浓度区间进行测试,因此测试可能需要多次调试样品浓度。

  温度对测试结果影响较大,所以测试前所用的试剂需要在标准规定的温度下平衡15分钟。

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