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α-半乳糖苷酶的酶活测定

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  小木虫论坛-学术科研互动平台生物医药区生物科学蛋白/酶α-半乳糖苷酶的酶活测定

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  大家好,我最近做α-半乳糖苷酶的酶活测定,自己克隆的酶验证有没有酶活,采用的方法是pNPG法,加入碳酸钠后不立即显色,而是过夜或好久才变黄色,是不是第五自己分解了,所以才变黄的,但是,我做了一个实验:

  (1)酶+缓冲液+底物,反应30 分钟————碳酸钠终止液。。没有立即变黄,,过了一天变黄,,时间变长颜色加深说明底物在有光环境下自己分解了吗??

  (2)酶+缓冲液+底物,反应30 分钟————不加入碳酸钠终止液。。。过了好多天不变黄。。。。待(1)变黄后,按照推理,底物应该也分解,加入碳酸钠,却没有变黄??为什么??

  1)酶+缓冲液+底物,反应30 分钟————碳酸钠终止液。。没有立即变黄:不能以变没有变黄为标准,而是以在420 nm下的吸光值变化为标准,人眼的分辨率是有限的。如果吸光值没有显著变化,就说明酶活很低甚至没有活性。

  过了一天变黄,,时间变长颜色加深:那可能是因为碳酸钠本身有肉碱性,会催化pNGP分解。

  (2)酶+缓冲液+底物,反应30 分钟————不加入碳酸钠终止液。。。过了好多天不变黄:那是因为对硝基酚需要在碱性条件下采用较大的吸光值。

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